Capitulo 1.- Introducción

La fermentación como antiguo arte.

La fermentación implica el empleo de microorganismos para llevar a cabo transformaciones de materia orgánica catalizadas por enzimas. A través de los siglos, se ah realizado como un proceso artesanal en la producción de diversos insumos, como por ejemplo, el vino (10.000 años a.C.), producción de cerveza (5000-6000 a.C.), el pan (4000 a.C), etc.

La producción de alimentos y bebidas modificadas mediante procesos de fermentación es operativa desde aproximadamente 10 000 años, antes de que se reconociera la existencia de los microorganismos.

Desde el punto de vista farmacéutico los quesos, la carne y el pan enmohecido se han empleado en la medicina popular, para curar heridas y tratar infecciones.

La era moderna de la tecnología de la fermentación industrial.

Tecnología microbiana

1. Antonie Van Leeuwenhoek, observo por primera vez las levaduras en gotas de cerveza fermentada, en el año de 1680. Este descubrimiento fue olvidado y el estudio de la fermentación quedo en manos de los químicos.  
2. Cagniard-Latour, Schwann y Kutzing (1836-1837), manifestaron de manera independiente que las levaduras eran una ''cosa'' viva. Afirmación que fue ridiculizada por algunos químicos, como Berzelius Wholer y von Liebig.
3. Blondeu (1847) estudió las fermentaciones que implicaban los ácidos butírico, láctico y acético, llegando a la conclusión de que eran producidos por diferentes tipos de ''hongos''.
4. Louis Pasteur (1856-7), concluyó que las levaduras vivas fermentaban el azúcar en etanol y dióxido de carbono al estar en ausencia de oxígeno. 

Dos elementos vitales condicionaron el inicio de la fermentación  industrial: empleo tradicional de mohos y levaduras en la modificación de alimentos y bebidas. La tecnología de los procesos fermentativos. La tecnología de los procesos de fermentación en superficie o semisólidos ha sido desarrollada a partir de la producción de alimentos orientales, como lo es la salsa de soja. La fermentación anaerobia, se emplea en la producción de bebidas alcohólicas. El cultivo de algas y mohos ha cimentado el proceso industrial de obtención de proteínas alimentarias microbianas (proteína unicelular). La producción tradicional de vinagre y los estudios de Pasteur sobre la producción de ácidos han preparado el camino para el desarrollo de fermentaciones que produzcan ácidos orgánicos.

Cultivo de células de animales y plantas.

Aunque las técnicas de cultivo de células de mamíferos in vitro se practican desde hace un siglo, los avances en esta área han tenido lugar más recientemente que los de la tecnología microbiana. 

Tabla. Historia del desarrollo del cultivo de células y tejidos.

Fermentaciones en alimentos.

Las fermentaciones alimentarias, como la producción de pan, queso y cerveza, así como la de bebidas alcohólicas, se han desarrollado hasta satisfacer las exigencias comerciales modernas de la producción a gran escala, cantidad constante y elevada costos competitivos y variedad de productos. La mejora en la eficacia se debe al uso de levaduras de panadería y cultivos ''starter'' para productos lácteos, así como el empleo de enzimas industriales.

La fermentación de la masa de pan se acelera con el uso de una mayor proporción de levaduras a temperaturas más elevadas. El empleo de amilasas microbianas libera los azúcares fermentables provenientes de los granos de almidón. Las proteasas se utilizan para hidrolizar parcialmente las proteínas del gluten de trigo, facilitando el manejo de la masa, incrementando el volumen de la hogaza y mejorando su forma.

El empleo de cultivos ''starter'' en la elaboración del queso es uno de los factores que han contribuido al desarrollo de una gran variedad de quesos de alta calidad.

La pasteurización ha permitido que la cerveza haya pasado de una escala de producción local a nacional e internacional; pasando rápidamente de ser unidades artesanales a grandes complejos cuyo objetivo es mantener un producto con características uniformes, aún bajo las fluctuaciones de las materias primas y la escala de operación. El proceso de fermentación se ha normalizad mediante el control de ciertos parámetros, como:

• Velocidad de inoculación.
• Viabilidad y condiciones de almacenamiento de levaduras.
• Concentraciones de oxígeno disuelto.
• Contenido de nitrógeno soluble.
• Azúcares fermentables en el mosto.
• Temperatura del proceso.

También se han aplicado las técnicas genéticas convencionales para mejorar las propiedades deseables de las levaduras y eliminar aquellas que son indeseables.

Levaduras de panadería y las proteínas de organismos unicelulares.

En el siglo XVII, los panaderos obtenían su levaduras de las fábricas de cerveza locales. Las primeras levaduras prensadas de panadería se obtuvieron aproximadamente en 1781 utilizando un proceso denominado ''Holandés'', posteriormente en 1846 se empleo el método ''Viena''. Ambos procesos tenían rendimientos bajos (de 5% y 14% respectivamente). Entre 1879 y 1919 los avances en las fermentaciones industriales de biomasa de levadura se condujeron a la producción industrial de levaduras de panadería. En 1879, Marquardt introdujo la aireación de la pasta de cereales, lo que aumentaba el rendimiento y disminuía la producción de alcohol al 20%.

En Alemania, las levaduras de panadería, se producían como suplemento proteico para el consumo humano, siendo este el primer proceso de fermentación moderno destinado a la producción de proteínas unicelulares. Empleando Candida utilis. 

La primera proteína microbiana aprobada por el gobierno inglés para consumo humano fue la ''Micoproteína'', producida a partir del hongo Fusarium graminearum. Su morfología filamentosa confiere a la proteína una textura natural similar a la de la carne.

Productos químicos y aditivos alimentarios.

Ácidos orgánicos

La producción comercial de ácido láctico inició en 1881 y aún hoy el 50% del ácido láctico utilizado a nivel industrial se produce por este método usando Lactobacillus delbruckii.

El ácido cítrico se produjo por extracción del zumo de limón y luego sintetizado a partir de glicerol y otros compuestos químico. El citrato se obtuvo por fermentación industrial, y la producción mundial sobrepasaba las 10 000 Tm, de las cuales más del 80% se obtenían por fermentación. Actualmente, se estima que son más de 350 000 Tm, producidas únicamente por fermentación.

Otros ácidos orgánicos manufacturados por fermentación son el ácido glucónico y el itacónico. El ácido acético de uso alimentario (vinagre) se obtiene exclusivamente por oxidación del etanol mediante Acetobacter aceti.

Alcoholes y cetonas

Durante la Primera Guerra Mundial se diseñó un proceso de fermentación para producir glicerol, usado en la fabricación de explosivos, basado en el descubrimiento de Neuberg, sobre que el compuesto era producido por levaduras. Durante la guerra, los ingleses satisfacieron sus necesidades de acetona por el desarrollo de un proceso de fermentación acetonabutanol anaerobio con Clostridium acetobutyllicum, siendo el primer proceso de fermentación a gran escala que necesitaba métodos de cultivo puros para prevenir la contaminación. Después de la guerra, la demanda de acetona disminuyó pero la de n-butanol aumentó, por lo que continúo produciéndose por fermentación hasta los años 50's. La fermentación acetona-butanol opero comercialmente hasta hace muy poco, debido a la escasez de petróleo originado por los embargos internacionales. La industria de la fermentación alcohólica se inició una vez revocada la prohibición, en 1977 acaparaba el 77% del mercado del alcohol industrial. En los 50's, el etileno era barato, debido al diseño de procesos de hiratación eficaces para su conversión en etanol. La crisis del petróleo hizo que el mundo se interesara en combustibles renovables alternativos, por ejemplo:

• Brasil: creó el programa nacional de alcohol que apuntaba al desarrollo de la capacidad de fermentación, que en 1987 producía 3 billones de galones de etanol anuales, a partir de caña de azúcar.
•  USA:  alentó el desarrollo de la producción de alcohol a partir de la fermentación del maíz mdiante el Gasohol Program, reduciendo los impuestos del ''gasohol''.

 También se obtiene etanol por la fermentación del suero de leche con Kluyveromyces fragilis, aunque el volumen de producción obtenido por este minúsculo comparado con el producido por S. cerevisiae  a partir de maíz o caña de azúcar. Y debe llevarse acabo en lugares próximos a las fabricas de quesos, ya que el costo de transporte de la materia prima, lo volvería incosteable.

Aminoácidos

La producción de aminoácidos por fermentación mediante procesos de fermentación aerobia ha experimentado una rápida expansión. El glutamato monosódico y la lisina son los que se producen en cantidades mayores, entre 370 000 Tm y 40 000 Tm, respectivamente. Los procesos de fermentación son el resultado de un elegante trabajo de investigación acerca de los mecanismos bioquímicos que regulan la síntesis de aminoácidos por los microorganismos. Las técnicas empleadas intentan estimular a las células, para prevenir o impedir las reacciones colaterales . 

Se han aplicado técnicas similares en la producción de monofosfatos de inosina y guanosina (potenciadores de sabor).

Biopolímeros

En los últimos años, la fermentación industrial se ah enfocado a la producción de biopolímeros microbianos. Los polímeros son sintéticos y por tanto son sensibles a las fluctuaciones del precio del petróleo; los biopolímeros son una alternativa viable durante una alza del precio de crudo.

El biopolímero más importante, según su volumen de producción es la goma de xantano, utilizada como gelificante o estabilizante de suspensiones. Es producida de manera aerobia de la bacteria Xanthomonas campestris. Existen otras gomas microbianas, por ejemplo: 

• Azetobacter vinelandii - Alginato
• Aurebasidium pullulans - Pululano
• Sclerotinum - Escleroglucano
• Pseudomonas elodea - Gelano

Un polímero muy prometedor que ésta siendo desarrollado actualmente es un polihidroxibutirato, que es un poliester termoplástico que se puede acumular intracelularmente en algunos tipos de Alicaligenes entrophus hasta un nivel del 70% en peso de biomasa. Este producto podría permitir el empleo de plásticos biodegradables.

Vitaminas

La mayoría de las vitaminas se producen por métodos químicos. Hay un gran número de métodos de fermentación, para vitaminas del grupo B, como la tiamina, biotina, ácido fólico, ácido pantoténico, piridoxina, vitamina B12 y rivoflavina. La síntesis química de la vitamina B12 se obtiene comercialmente mediante fermentación industrial con Pseudomonas. En la producción de rivoflavina los procesos de fermentación compiten eficazmente con los métodos de síntesis química, por lo que sólo la tercera parte del volumen de producción de esta vitamina se obtiene por fermentación. Una patente reciente describe una cepa recombinante de Bacillus subtilis capaz de producir 4.5 g de rivoflavina en 24 h de fermentación, período inferior al necesario con los Ascomycetes, que se aproxima a los 5 días.

Insecticidas microbianos

Los insecticidas químicos, se emplearon con gran éxito durante este ciclo. Sin embargo, las críticas acerca de que pueden matar organismos distintos al blanco o de que los organismos blanco pueden volverse resistentes a ellos han conducido al desarrollo y comercialización de insecticidas microbianos. La producción de Bacillus thuringensis supera con mucho la de cualquier otro insecticida microbiano, producido comercialmente. Las condiciones de fermentación se diseñan de tal modo que alcance un rendimiento y una bioactividad de la endotoxina, producida de manera concomitante con la esporulación. Las cepas de este microorganismo son capaces de sintetizar insecticidas bacterianos y fúngicos, que manifiestan toxicidades diversas.

Giberelinas

Las giberelinas, se aplican para la aceleración de la germinación de la cebada en la producción de malta. Fue descubierta en 1938. El ácido giberélico se produjo inicialmente mediante cultivo en superficie en una fermentación prolongada, consiguiéndose rendimientos de 40-60 mg/l de producto. Las fermentaciones comerciales en cultivos sumergidos producen rendimientos significativamente mayores.

 Enzimas microbianos

La exportación comercial de enzimas microbianos aislados fue iniciada por Jokichi Takamine, un japonés que en 1894 patentó un método para la preparación de enzimas diastáticos a partir de mohos. Este método, implica el crecimiento de los mohos en la superficie de un substrato sólido. El desarrollo de fermentaciones de enzimas industriales bacterianos fue iniciado por Boidin y Effront, en 1917 patentaron el empleo de Bacillus subtilis y Bacillus mesentericus para obtener amilasas y diastasas, mediante técnicas de cultivo en superficie. Las fermentaciones fúngicas sumergidas se emplearon en USA y Europa para la producción de enzimas basándose en la experiencia conseguida con las fermentaciones sumergidas en el desarrollo del proceso de producción de Penicilium.

La introducción de enzimas microbianos industriales en el mercado estableció el fundamento de la tecnología para la aplicación de enzimas, en áreas del procesado de alimentos como la producción de cerveza y zumo de frutas y la manofactura de hidrolizados de almidón. La producción y empleo de glucosa isomerasa microbiana para la manufactura de jarabes de maíz ricos en fructosa representó un hito muy importante en la década de los 60's. Ésta década consistió en la comercialización de a-amilasa estable a temperaturas elevadas obtenida a partir de Bacillus licheniformis.

Productos de uso médico

Antibióticos

Alexander Fleming observó que el Penicillium notatum, contaminante de los cultivos de Staphylococcus aureus, mataban las bacterias, demostrando que el ingrediente activo, denominado penicilina, podía inhibir otras muchas bacterias. Una vez aislada en forma activa estable (por Florey y Chain en 1940), se demostró su destacada actividad antibacteriana y se desarrolló en USA un proceso de fermentación comercial.
El desarrollo con éxito de la obtención por fermentación de la penicilina marcó el inicio de la industria de los antibióticos. Por ejemplo:

1. Streptomyces, producción de estreptomicina.
2. Cephalosporium acremonium, productor de cefalosporinas.

Estos compuestos fueron los primero antibióticos importantes descubiertos desde los años 40, sin embargo desde entonces y en la actualidad se siguen aislando anualmente cientos de nuevos antibióticos. La edad de oro de la genética microbiana clásica, que implicaba técnicas de mutación y selección, iniciada aproximadamente en el año 1940, ha permitido incrementar los rendimientos de producción durante la fermentación.

Transformaciones de esteroides

El empleo de microorganismos para llevar a cabo transformaciones enzimáticas altamente selectivas y especificas de productos farmacéuticos representó un avance decisivo en el desarrollo de medicamentos con hormonas esteroides.

La cortisona, esteroide que alivia el dolor de los pacientes con artritis reumatoide, es producido mediante una síntesis química que consta de 37 etapas, a un costo de 200$ el gramo. Sin embargo, en 1952, Upohn Compañy descubrieron que la cepa de Rhizopus arrhizus, hidroxiladora de progesterona, podía disminuir el proceso de 37 a 11 etapas, y aun costo de 16$.

Se han aplicado técnicas de biotransformación microbiana similares para la síntesis de otros esteroides, como aldosterona, prednisona y prednisolona.

Vacunas

La capacidad de conferir resistencia a la enfermedad mediante vacunación fue descrita en primer lugar por Jenner, en 1798, quien observó que los individuos inoculados con viruela vacuna o ''viccinia'' eran inmunes a la enfermedad. 

• El empleo de vacunas, y la inmunología, comenzaron hacia 1877, cuando Pasteur dirigió su atención a las causas y forma de prevenir las enfermedades infecciosas en los humanos y los animales.
• En 1890, Behring y Kisato inmunizaron animales con toxinas inactivas de difteria y tétanos. Koch aisló Vibrio cholerae.
• En 1894, la primera vacuna para el cólera fue aplicada por el médico Ferran y Clua.
• Durante la primera Guerra Mundial, soldados sometidos a programas de vacunación contra el tifus.
• Segunda Guerra Mundial, sigue un programa similar contra el tétanos.
• 1936. Calmette y Guérin observaron que los cultivos de bacilos infecciosos en un medio artificial durante cierto tiempo, atenuaban su actividad hasta el punto de ser incapaces de desarrollar la enfermedad.
• 1939, se introduce la vacuna de BCG que inmunizaba contra tuberculosis. 

La tecnología de las vacunas víricas fue primitiva durante muchos años, debido a la necesidad de emplear animales como fuentes de virus. Hacia 1950, se desarrollaron técnicas de cultivo celular. Con ellas, la producción de vacunas víricas entró a formar parte del campo de la fermentación industrial, ya que permitía producir mucho más virus mucho menos contaminados por materiales extraños del huésped, bacterias o virus, que estaban presentes en los obtenidos por los métodos antiguos.

Impacto de las tecnologías de hibridomas y de DNA recombinantes

Anticuerpos monoclonales

En 1975, Kohler y Milstein fusionaron un mieloma de ratón con un glóbulo blanco productor de anticuerpos obteniendo una célula híbrida (hibridoma) que combinaba distintas capacidades de la célula padre. También desarrollaron la tecnología básica para la producción de anticuerpos monoclonales. Estos tienen una elevada especificidad de unión a receptores individuales. El mercado de anticuerpos monoclonales creció rápidamente. Su producción se lleva a cabo in vivo por inyección del clon del hibridoma en el líquido de la cavidad abdominal del animal o in vitro en una gran variedad de sistemas de cultivo celular. 

Tecnología del DNA recombinante

La ingeniería genética implica la formación de nuevas combinaciones de material genético mediante la inserción de genes extraños, producidos fuera de la célula, a un organismo huésped en el que no existen de manera natural. El primer gen clonado en 1973, podía producir proteínas ''extrañas'' en cantidades comerciales. La industria farmacéutica a invertido mucho en investigación y desarrollo en este campo. El primer producto para uso terapéutico fue la insulina humana producida por una cepa recombinante de E. coli. La primera vacuna obtenida mediante infeniería genética comercializada ha sido una vacuna de uso veterinario introducida en 1986 contra la pseudorrabia (herpes en los cerdos).

Las investigaciones pioneras sobre ingeniería genética y los primeros productos comercializados utilizaron E. coli como huésped. Los caballos de batalla de la fermentación industrial, Bacillus, Aspergillus y Saccharomyces pueden ser mejores huéspedes a largo plazo. Como los procariotas no glucosilan las proteínas, las diferentes especies de Saccharomyces y Aspergillus pueden ser los huéspedes adecuados para la producción de glicoproteínas animales o humanas. 

Los sistemas de secreción y síntesis proteica son significativamente más complejos en estos microorganismos eucariotas que en los procariotas, por lo que tienen que ser investigados más completamente.

Las proteínas y los péptidos, son el primer objetivo obvio de producción mediante la tecnología de DNA recombinante.

Fuente:

P. WARD, OWEN, Biotecnología de la fermentación, Editorial Acribia S. A., Zaragoza, España, 1991.