Introducción
Los productos comercialmente importantes de las fermentaciones pertenecen a 4 categorías principales:
- Células microbianas.
- Moléculas como polímeros y polisacáridos.
- Productos básicos.
- Metabolitos secundarios.
Microorganismos industriales
En la naturaleza existen dos clases fundamentales de células:
- Procariotas: carecen de un núcleo definido, por lo que su DNA no esta separado del resto de los constituyentes celulares, tampoco poseen mitocondrias, poseen un plásmido además del DNA.
- Eucariotas: tienen un núcleo especifico rodeado por su propia membrana, su DNA esta asociado a proteínas y se encuentra estructurado en cromosomas, posee otros orgánulos con funciones bioquímicas/ fisiológicas especificas.
Los microorganismos también se distinguen en función de sus necesidades de oxigeno, pudiendo dividirse en aerobios estrictos (Streptmices) y los anaerobios estrictos (Clostridia).
Las bacterias implicadas en los procesos de fermentación son principalmente quimiorgánotroficos, ya que pueden obtener su energía y su carbono por la oxidación de los compuestos orgánicos. Éstas pueden dividirse en:
- Gram-positivas: su membrana citoplásmatica esta recubierta en gran parte una capa de peptidoglicanos (15-18 nm espesor). Coloración violeta.
- Gram-negativas: su capa de petidoglicanos es de 2-3nm de espesor. Tienen dos membranas la externa y la citoplasmática, separadas por el espacio periplásmico. Coloración rojiza.
Imagen. División asexual de E. coli.
Los hongos también son quimioorganótroficos con hifas filamentosas rígidas y ramificadas cuyo diámetro comprede entre los 2 -18 nm. Los más importantes implicados en las fermentaciones industriales, se clasifican principalmente en dos grupos:
- Zygomycotina: Producen micelios vegetativos haploides. Sus esporas se forman en el esporangio, pueden reproducirse de manera sexual. Los principales constituyentes de sus paredes celulares son el quitosano y la quitina. Entre ellos se reconocen los géneros Mucor y Rhizopus.
- Deuteromycotina: Su micelio también son haploides. Sus esporas asexuales son inducidas por determinadas condiciones medioambientales. En su pared celular predominan el glucano y la quitina. Se reconocen los géneros Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Aureobasidum y Fusarium.
La levadura más utilizada en las fermentaciones industriales es S. cerevisiae, sobre todo en la producción de alcohol y panadería. Sin embargo, no degrada la lactosa, por lo que para producir alcohol o biomasa a partir de lactosuero se utiliza Kluyveromyces lactis.
Las células de los mamíferos son más complejas, debido a que normalmente se encuentran el medios isotónicos controlados, no tienen paredes celulares exteriores resistentes. En los tejidos distintos de los reproductivos, las células son diploides y se dividen aproximadamente cada 24 horas. Sus necesidades nutritivas son muy sensibles a las fluctuaciones de los parámetros como temperatura, pH, y el oxígeno y CO2 disueltos.
Las líneas celulares preparadas directamente a partir de tejidos animales generalmente no sobreviven, o exhiben inhibición por contacto, es decir, detienen su crecimiento cuando se tocan entre ellas.
Las células de hibridomas se construyen fusionando una célula de mieloma con una célula productora de anticuerpos, de forma que las células híbridas tienen las características de las células transformadas y a la vez son capaces de sintetizar un único anticuerpo, denominado anticuerpo monoclonal.
Muchos tipos de células vegetales pueden crecer en un medio sólido o en suspensión mediante técnicas similares a las empleadas para el cultivo de células animales; el medio puede ser complejo e incluir extractos de plantas y auxinas y carbohidratos. Los tejidos vegetales crecen un medio sólido como un callo formado por una mezcla de células parenquimatosas. El cultivo en suspensión es el método de cultivo de células vegetales más utilizado, y su principal ventaja es que puede conseguirse un medio homogéneo a lo largo de un reactor.
Los virus son agentes submicroscópicos que infectan a las plantas, los animales y las bacterias, poseen un genoma formado por DNA o RNA rodeado por una capa proteica. No poseen citoplasma o membrana y se replican dentro de las células huésped específicas mediante los sistemas biosintéticos de la propia célula. Las vacunas víricas se obtienen por infección de células huéspedes cultivadas. Los bacteriófagos infectan los procesos de fermentación de la cepa microbiana y causan serios problemas, particularmente en los cultivos ''starter'' utilizados en la fabricación de quesos.
Crecimiento celular
El crecimiento de los microorganismos es una parte integral de casi todos los procesos de fermentación. La morfología del crecimiento influye invariablemente en la velocidad de crecimiento y en la formación de productos.
Cuando un microorganismo se inocula en un volumen de medio dado, el cultivo pasa por una serie de fases:
Imagen. Fases de crecimiento microbiano y calculo de cada una.
Donde:
N = Concentración celular (mg cm -3)
t = Tiempo de incubación (h)
u = Velocidad de crecimiento específico (h-1)
k = Cte. de velocidad
La velocidad de crecimiento varía con el tipo de célula microbiana y en función de las condiciones medioambientales físicas y químicas. El tiempo para que se duplique la biomasa aumenta con la complejidad del organismo, de forma que lo tiempos de duplicación medios para las células animales y vegetales son substancialmente mayores que lo mohos y las levaduras, que a su vez son mayores que los de las bacterias.
También varía en función de la temperatura. La mayoría crecen entre los 25-30°C aunque la temperatura real a la que crece un microorganismo depende de su naturaleza psicrofílica, mesofílica o termofílica moderada o extrema. La velocidad de crecimiento aumenta con la temperatura hasta un máximo, por encima del cual la velocidad cae rápidamente debido al incremento de la tasa de muerte microbiana. El efecto de la temperatura en la velocidad de crecimiento puede ser descrito por la ecuación de Arrhenius.
Ecuación de Arrhenius.
Donde:
A= cte de Arrhenius.
Ea= Energía de activación (kcal mol-1)
R= Cte de gases ideales
T= temperatura absoluta.
El pH influye en el crecimiento microbiano de la misma forma que lo hace en la actividad enzimática. La mayoría de los microorganismos crecen dentro de un rango de pH comprendido entre 3 y 4 unidades.
La velocidad de crecimiento depende de la actividad de agua o húmedad relativa:
Aw= Ps/Pw
donde:
Ps= presión de vapor de agua de la solución
Pw= presión de vapor de agua pura
La velocidad depende también de la concentración de nutrientes químicos, pudiendo describirse por la ecuación Monod:
Donde:
Umax= vel. crecimiento específica máxima
s= concentración residual del sustrato limitante
Ks= Cte. saturación, equivalente a la concentración de sustrato a U= 0.5 Umax.
Imagen. Influencia de la concentración de sustrato limitante en la velocidad de crecimiento especifico.
Los valores típicos de Ks para diversas fuentes de carbono están comprendidos entre 1 y 10 mg dm-3. Las células pueden crecer a velocidades próximas a Umáx cuando tiene una fuente de carbono limitante es mayor que 10 Ks o 10-100 mg dm-3. Las concentraciones de carbohidrato elevadas pueden inhibir el crecimiento debido a los efectos osmóticos.
La cantidad de masa celular total formada durante el crecimiento celular es frecuentemente proporcional a la cantidad de substrato utilizado.
- Yx/s = Biomasa producida (g) / Substrato consumido (g)
Metabolismo
Metabolismo primario
El crecimiento microbiano depende de la capacidad de la célula para utilizar los nutrientes de su medio ambiente y sintetizar los compuestos macromoleculares de las estructuras celulares y también los principales compuestos de peso molecular bajo necesarios para la actividad celular. El metabolismo intermediario incluye las reacciones que transforman los compuestos de carbono y nitrógeno que entran a la célula en un nuevo material. La síntesis de estos compuestos necesita energía, y la mayoría obtienen su energía a partir de la ruptura de compuestos orgánicos. En los procesos respiratorios o aerobios, los organismos son capaces de oxidar completamente algunos de los sustratos a CO2 y H2O.
Las rutas productoras de energía o catabólicas generan ATP y los coenzimas reducidos necesarios para las diversas reacciones biosintéticas.
Los azúcares se rompen por una de las tres vías:
- Embden-Meyerhof-Parnas (EMP): convierte la glucosa en dos moléculas de piruvato a través de la triosa fosfato, ésta ruta esta presente en las células animales, plantas, hongos, levaduras y bacterias.
- Hexosa monofosfato (HMP): Un ciclo de ésta ruta da lugar a la conversión neta de glucosa en CO2 con producción de 12 moléculas de NADPH + H+
- Entner-Doudoroff (ED): está relativamente rstringida, ya que la utilizan pocas bacterias, entre ellas Pseudomonas, que no metabolizan la glucosa por la ruta EMP.
Los intermediarios del TCA también sirven como precursores para la biosíntesis de muchos aminoácidos, algunos ácidos orgánicos y otros productos de fermentación. Los microorganismos que crecen utilizando como fuentes de carbono ácidos grasos y acetato, o sus precursores, utilizan el TCA para la producción de energía y de las materias primas para los procesos biosintéticos.
Imagen. Reacciones anapleróticas del Ciclo de Krebs.
Las hexosas se convierten en proteínas de organismos unicelulares (SCP) mediante la acción de levaduras y hongos utilizando generalmente una combinación de las rutas EMP y HMP, seguidas del cicl TCA y la respiración. Su producción (SCP) a partir de alcanos implica la oxidación del alcano a unidades de acetato y su asimilación por los ciclos del glioxilato y de los TCA, mediante los enzimas de las rutas EMP y HMP utilizados para la biosíntesis de hexosas, pentosas y otros constituyentes celulares. En la producción de SCP a partir de metanol por las especies de Methylophilus, el sustrato es convertido en formaldehído y luego oxidado por la vía de la ribulosa fosfato.
En el proceso de fermentación para la obtención de ácido cítrico, utilizando Aspergillus niger, las hexosas se convierten en piruvato y acetil CoA, que se condensa con el oxalacetato para dar citrato, luego es impedida su degradación mediante la inhibición de la enzima. El oxalacetato necesario para una reacción de condensación se obtiene por carboxilación del piruvato. La producción de ácido glutámico y lisina por Corynebacterium y Brevibacterium implica la ruta EMP, el TCA, y varios mecanismos anapleróticos.
Imagen. Rutas metabólicas anaerobias y sus productos finales.
- En la producción de ácido L-láctico por fermentación industrial con Lactobacillus desbrukii, el piruvato formado a partir de la hexosa se convierte en lactato por la acción de la enzima L-lactato deshidrogenasa.
- El ácido acético puede producirse biológicamente por conversión aerobia de etanol en acetato, con un rendimiento estequiometrico global de 0.66 a partir de glucosa. Los Clostridium thermoaceticum fermentan 1 mol de glucosa dando 3 moles de acetato por la vía del piruvato.
- El Clostridium acetobutylicum convierte el piruvato en una mezcla de acetona y butanol.
Metabolismo secundario
Los metabolitos secundarios son compuestos que no son necesarios para la biosíntesis celular, no tienen por tanto un papel directo en el metabolismo energético. Entre estos compuesto se tiene, principalmente, a los antibióticos, útiles porque pueden inhibir a otros organismos que puedan competir por los nutrientes disponibles, otros funcionan como efectores de diferenciación, agentes de simbiosis o en los factores de los ciclos sexuales.
La biosíntesis de metabolitos secundarios está estrechamente relacionada con el metabolismo primario de las células, puesto que sus precursores son metabolitos primarios normales o modificados (ácidos orgánicos, unidades de isopreno, aminoácidos alifáticos y aromáticos, derivados de azúcares, del ciclitol y bases púricas o pirimidícas. El grupo más importante de los metabolitos secundarios son los antobióticos, entre otros como el ácido giberélico, los alcaloides, sustancias antitumorales, inmunomoduladores e insecticidas. A partir de los vegetales pueden extraerse una gran cantidad de metabolitos secundarios de alto valor, como los derivados farmacéuticos, sustancias aromatizantes como la quinina, o insecticidas.
Regulación del metabolismo
Una célula tiene el potencial genético necesario para producir aproximadamente 1000 enzimas, que deben ser sintetizadas en proporciones correctas y deben trabajar en forma coordinada para un correcto funcionamiento eficiente de la célula. Los microorganismos son capaces de alterar su composición y metabolismo en respuesta a cambios medioambientales, sus principales reguladores operan a nivel de la síntesis de enzimas como de modificación de su actividad.
El proceso de fermentación puede verse influido por una gran variedad de mecanismos. Los enzimas limitantes de la velocidad están situados estratégicamente en las diversas rutas, y son sensibles a mecanismos de inducción/represión y activación/inhibición. La sobreproducción de metabolitos primarios se debe a las velocidades de flujo diferencial que dan lugar a la acumulación del metabolito. Los procesos que requieren la producción de metabolitos secundarios son más complejos y menos conocidos.
En el desarrollo de los procesos de fermentación para la sobreproducción de un metabolito particular, es esencial tener en cuenta los diversos procesos de regulación en el diseño de las condiciones medioambientales óptimas, y el aislamiento o manipulación de las cepas microbianas productoras.
Síntesis y degradación de enzimas
En las células, las proteínas están siendo degradadas continuamente bajo la acción de los enzimas proteolíticos, por lo que cada enzima tiene una vida limitada. Las proteínas varían su susceptibilidad frente al ataque proteolítico, de forma que la síntesis neta de una enzima se produce cuando su velocidad de síntesis es superior a la de degradación.
Imagen. Síntesis proteica en (a) procariotas y (b) eucariotas.
- (a) Una única RNA polimerasa reconoce y se une a los promotores, iniciando la síntesis del RNAm y la transcripción del operón. En el extremo del gen estructural, una región de terminación hace que la RNA pol. cese la transcripción y se disocie del DNA. Las RNAm son policistrónicos.
- (b) Los RNAm son monocistrónicos. La síntesis de cada proteína se inicia por la unión de los ribosomas a un centro específico del RNAm y la traducción comienza antes de que la RNA pol. alcance la seña de terminación.
Inducción
Los genes estructurales de los enzimas inducibles son normalmente inactivos u operan a velocidades ''basales'' muy bajas en ausencia de sustrato. Cuando el sustrato se encuentra presente, el gen estructural se pone en marcha y se produce la transcripción y la traducción; este proceso se ilustra según el modelo de Jacob y Monod. En ausencia de un inductor, un gen regulador sintetiza un represor que se une a un gen operador, evitando que la RNA polimerasa se mueva a lo largo del DNA para transcribir el gen estructural. En presencia del inductor, éste de une al represor, arrancándolo del gen operador y permitiendo que tenga lugar la transcripción.
Imagen. Representación de un sistema enzimático inducible.
Represión por el catabolito
Ocurre cuando la célula crece en un medio que contiene más de un sustrato utilizable para el crecimiento. Se sintetizan enzimas que catabolizan el mejor sustrato (glucosa), y sólo cuando se éste se ah agotado se producen enzimas que descomponen el sustrato más pobre. Las inhibición de la formación 3'-5'-adenosín monofosfato cíclico (AMPc) es el factor clave de la represión por el catabolito. El metabolismo de la glucosa reduce el contenido de AMPc de la células una 1000 veces. El nivel de AMPc depende de la adenil ciclasa y de la AMPc fosfodiesterasa, que sintetizan y degradan el AMPc.
Muchos enzimas son reprimidos por la presencia de aminoácidos o amoniaco.
Muchos enzimas son reprimidos por la presencia de aminoácidos o amoniaco.
Represión feedback
La biosíntesis de enzimas anabólicos puede estar regulada por la represión feedback producia por el producto final. La represión feedback se utiliza ampliamente en la naturaleza para controlar la síntesis de aminoácidos, purinas, pirimidina y vitaminas. En el modelo clásico de represión feedback el gen regulador produce una proteína apo-represora combinada con un co-represor (producto final), se une al centro operador y bloquea la transcripción.
Modulación de la actividad enzimática
Muchos enzimas tienen uno o más centros alostéricos, que ligan reversiblemente metabolitos particulares o moléculas efectoras, produciendo un cambio en la configuración del enzima y por tanto aumentando o disminuyendo su actividad. Compuestos como el ATP, el ADP, el AMP y los nucleótidos de nicotinamida también modulan la actividad enzimática y controlan el metabolismo ajustando el balance de los procesos catabólicos y anabólicos.Regulación de las rutas metabólicas ramificadas
Las rutas metabólicas tienen frecuentemente una secuencia de enzima común con ramificaciones que conducen a la formación de más de un producto final. Los microorganismos han desarrollado mecanismos de retroalimentación (feedback), por los cuales la acumulacion del producto final causa un efecto en el primer enzima de la rama que conduce a ese producto. Este efecto se consigue a nivel biológico mediante el uso de isoenzimas y mecanismos de regulación ''feedback'' concertados y acumulativos. Estos efectos reguladores pueden ser de dos tipos:
- Inhibición de la actividad enzimática: puede estar regulada por un producto final distinto.
- Represión de la síntesis de enzimas: sólo está implicado un enzima, pero debe haber más de un producto que inhiba su actividad.
Asimilación del sustrato/secreción del producto
En los procariotas, el sustrato se mueve dentro y fuera de la célula directamente atravesando las membranas asociadas con la envoltura celular. Algunas fermentaciones bacterianas han sido manipuladas para alterar la membrana celular o la composición de la pared con objeto de modificar los mecanismos de entrada o facilitar la excresión. Algunos materiales son transportados a la célula por endocitosis.
Los solutos son transportados a través de las membranas sin modificación:
- (a) por difusión pasiva a favor de un gradiente de concentración.
- (b) por difusión facilitada por un gradiente de concentración.
- (c) por transporte activo.
Secreción de enzimas
Las procariotas y eucariotas Gram-positivos tienen una única membrana plasmática en su superficie. Las paredes de las bacterias Gram-negativas tienen dos membranas, separadas por un espacio periplásmico. Los enzimas extracelulares, sintetizados por las bacterias Gram-positivas, son transportados a través de la membrana citoplasmática, difundiéndose por la pared celular y acumulándose en el líquido de cultivo extracelular. Los enzimas extracelulares son sintetizados por los eucariotas en la superficie del retículo endoplásmico y transportados a través de la membrana al espacio de dicho retículo.
Imagen. Secreción de enzimas en eucariotas.
La glicosilación de produce en el espacio vesicular del retículo y en los cuerpos de Golgi. Esta ruta secretora general, es similar en eucariotas superiores y levaduras, y puede producirse en hongos filamentosos.
Las proteínas secretadas a través de las membranas contienen usualmente un péptido amino terminal de extensión, denominado secuencia de señal. El péptido señal, interacciona con la superficie más interna de la membrana plasmática de la bacteria o con el retículo endoplásmico, formando un poro o canal. Éste se elonga y pasa a través de la membrana, en un proceso conocido como secreción co-traduccional, y una peptidasa señal localizada en la parte externa de la membrana elimina el péptido señal, permitiendo a la proteína asumir su estructura tridimensional normal. Algunas proteínas extracelulares son secretadas después de que han sido sintetizadas en un proceso conocido como secreción post-traduccional.
Imagen. Secreción co-traduccional.
Fuente:
P. WARD, OWEN, Biotecnología de la fermentación, Editorial Acribia S. A., Zaragoza, España, 1991.
P. WARD, OWEN, Biotecnología de la fermentación, Editorial Acribia S. A., Zaragoza, España, 1991.
